信息來源于： 發(fā)布于：2022-11-01
熒光光譜儀是一種用于掃描液體熒光標(biāo)記物發(fā)出的熒光光譜的儀器。它可以提供許多物理參數(shù)，包括激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、熒光強(qiáng)度、量子產(chǎn)率、熒光壽命、熒光偏振等。從各個(gè)角度反映了分子的成鍵和結(jié)構(gòu)。那么熒光光譜儀怎么設(shè)置呢？下面來解答一下！
1、激發(fā)波長的選擇
如何確定激發(fā)波長和發(fā)射波長？對于許多樂器初學(xué)者來說，這是一個(gè)令人困惑的問題。如果儀器有三維掃描功能，就比較簡單了。把樣品放進(jìn)去，按照說明做三維熒光掃描，可以很容易的確定合適的激發(fā)波長和發(fā)射波長。如果儀器沒有3D掃描功能，一般方法如下。
首先將儀器的激發(fā)波長(λem)設(shè)置為200nm，然后進(jìn)行發(fā)射(EM)模式掃描，發(fā)射波長(λEM)的掃描范圍暫定為210 ~ 800 nm，記錄所有的峰值波長。更改激發(fā)波長(λem ),然后掃描。如果在第二發(fā)射光譜中的某個(gè)峰(或多個(gè)峰)的位置沒有位移(或位移很小)，一般來說，該峰(或多個(gè)峰)是熒光峰；因?yàn)闊晒夥宓奈恢貌浑S激發(fā)波長的變化而變化，只是峰高(或峰面積)發(fā)生變化。
然后，將確定的熒光峰的波長固定為發(fā)射波長(λem)，然后掃描激發(fā)波長(Ex)，其范圍小于發(fā)射波長；如果只有一個(gè)激發(fā)峰，很容易建立起來，然后固定這個(gè)波長再做一次真實(shí)發(fā)射波長(EM)掃描，就可以得到很好的信噪比。如果掃描激發(fā)波長(EX)后出現(xiàn)幾個(gè)峰，應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)選擇。一般應(yīng)選擇峰形、適宜性高、有一定帶寬的峰作為激發(fā)波長。激發(fā)波長也可以通過參考熒光光譜的特性-激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的鏡像來確定。
2、過濾器的選擇
當(dāng)掃描和分析發(fā)射光譜時(shí)，根據(jù)斯托克斯定律，設(shè)定的激發(fā)波長比發(fā)射波長短。例如，如果激發(fā)波長λex=260nm，則發(fā)射起始波長應(yīng)該從大于260nm的波長開始，例如270nm，發(fā)射終止波長應(yīng)該是870nm。這樣，在激發(fā)光的兩倍(520nm)和三倍(780nm)處會(huì)出現(xiàn)激發(fā)波長的尖銳倍頻峰。如果與熒光光譜峰重疊，會(huì)對測試產(chǎn)生干擾，所以需要選擇合適的濾光片將其濾除。
倍頻峰是激發(fā)光的散射峰。雖然掃描到兩倍波長時(shí)出現(xiàn)波長，但實(shí)際波長是激發(fā)波長?？梢酝ㄟ^添加高通濾波器來消除倍頻峰值。一般高通濾波器放在發(fā)射處，芯片上標(biāo)有能濾出的最大波長。也就是說，在系統(tǒng)中加入高通濾波器后，比上面標(biāo)注的波長更低的光，包括這些光的雙波長光和三波長光，都會(huì)被過濾掉；而波長高于其標(biāo)示波長的光可以順利通過。
3、狹縫的設(shè)置
熒光強(qiáng)度與許多因素有關(guān)，如分子結(jié)構(gòu)、存在狀態(tài)、溶液濃度或薄膜厚度、溫度、選擇的激發(fā)波長、測試狹縫的寬度等。不同儀器測得的熒光強(qiáng)度值差異較大，不具有可比性，但其峰值位置容易確定，可以用來判斷是哪種物質(zhì)。定量熒光分析必須固定一些條件。
狹縫的大小對熒光強(qiáng)度非常重要。狹縫的大小可以根據(jù)被測物質(zhì)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。在相同濃度下，如果熒光強(qiáng)度過高，超出儀器的測量范圍，可以減小狹縫。但是，需要指出的是，熒光強(qiáng)度的變化不僅僅是狹縫的大小，還有分辨率。對于熒光掃描，狹縫的增加可以提高熒光強(qiáng)度和重現(xiàn)性，但分辨率下降。確定狹縫的分辨率，儀器的其他結(jié)構(gòu)已經(jīng)固定(光柵刻線數(shù)量、焦距、綜合線性色散系數(shù))，狹縫的大小決定了分辨率。對于實(shí)際應(yīng)用，狹縫尺寸需要與測量峰的半峰寬相匹配。如果太大，峰會(huì)變形。狹縫的大小也決定了光通量。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)值，狹縫擴(kuò)大1倍，光通量會(huì)增加4倍。
4、步長設(shè)置
測量步長越小，測量越慢，地圖越細(xì)膩；步長越長，測量速度越快，譜圖越粗糙。步長應(yīng)小于待測最小FWHM的1/5，因?yàn)椴介L與分辨率有關(guān)。原則上，步長應(yīng)小于狹縫寬度的3倍。
